Мясо. Методы бактериологического анализа
Заменяет
Страница 1
Страница 2
Страница 3
Страница 4
Страница 5
Страница 6
Страница 7
Страница 8
Страница 9
Страница 10
Страница 11
Страница 12
Страница 13
Страница 14
Страница 15
Страница 16
Страница 17
Страница 18
Страница 19
Страница 20
Страница 21
Страница 22
Страница 23
Страница 24
Страница 25
Страница 26
Страница 27
Страница 28
ГОСТ 21237-75
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
МЯСО
МЕТОДЫ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
И здание официальное
Группа 1119
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
МЯСО
Методы бактериологического анализа
ГОСТ
, NfcaL 21237-75
Methods ol bacteriological analysis
МКС 07.100.30 67.120.10 ОКСТУ 9209
Дата введения 01.01.77
Настоящий стандарт распространяется на мясо и субпродукты от всех видов убойного скота и устанавливает методы бактериологического исследования для выявления в них аэробных бактерий (бацилл сибирской язвы, бактерий из рода сальмонелл, бактерий из рода кишечной палочки-Эшери-хий, бактерий из рода протея, бактерий рожи свиней, бактерий листерноза, бактерий пастереллеза, бактерий из группы кокков) и анаэробных бактерий (патогенных и токсигенпых клостридий).
Бактериологическое исследование мяса и субпродуктов производят во всех случаях, предусмотренных действующей нормативно-технической документацией, правилами ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясопродуктов и другими нормативными актами, а также по требованию органов, осуществляющих ветеринарный или санитарный надзор.
(Измененная редакция, Изм. № 2).
1. МЕТОДЫ ОТБОРА ОБРАЗЦОВ
1.1. В зависимости от характера заболевания на бактериологическое исследование направляют от
туши:
— часть мышцы сгибателя или разгибателя передней и задней конечностей туши длиной не менее 8 см или кусок другой мышцы размером не менее 8 66 см;
— лимфатические узлы — поверхностный шейный или собственно подкрыльцовый и наружный подвздошный вместе с окружающей их соединительной и жировой тканыо. а от свиней — поверхностный шейный дорзальный (при отсутствии патологических изменений в области головы и шеи) или подкрыльцовый первого ребра и надколенный;
— долю печени с печеночным лимфатическим узлом или желчным пузырем, освобожденным от желчи, почку и селезенку.
Для бактериологического исследования на листериоз направляют: головной мозг, долю печени и почку.
Для бактериологического исследования на возбудителя сибирской язвы направляют лимфатический узел пораженного органа или лимфатический узел, собирающий лимфу с места локализации подозрительного фокуса, отечную ткань, ухо. а у свиней, кроме того, подчелюстной лимфатический
узел.
При исследовании полугуш или четвертин туш берут кусок мышцы, лимфатические узлы и трубчатую кость.
При исследовании соленого мяса, находящегося в бочечной rape, берут образцы мяса и имеющиеся лимфатические ухты сверху, из середины и со дна бочки, а также, при наличии, трубчатую кость и рассол.
Примечание. Если берут часть печени, почки, селезенки, то поверхность разреза прижигают.
1.2. Образцы завертывают каждый в отдельности в полиэтиленовую пленку по ГОСТ 10354 или пергамент по ГОСТ 1341, помещают в бумажный пакет, на котором ставят дату отбора образца, номер туши и направляют в лабораторию в обшей таре (ящике).
Издание официальное *
Перепечатка воскрешена
ГОСТ 21237-75 С. 2
1.3. При необходимости пересылки образцов в лабораторию, расположенную за пределами предприятия или хозяйства, где отбирают образцы, тару с образцами опечатывают или пломбируют.
В сопроводительном документе указывают:
— наименование продукта с указанием вида мяса, от которого взят образец, и его количество;
— наименование предприятия или хозяйства, где отобран образец, и его адрес;
— номера образцов:
— причину напраачення образцов на исследование;
— краткие патологоанатомические данные и предполагаемый диагноз:
— дату взятия образцов и подпись лина. направившего их на исследование.
2. АППАРАТУРА, МАГЕРИА11Ы, РЕАКТИВЫ И ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ
2.1. Для проведения бактериологического исследования применяют:
автоклав;
аппарат Коха;
баню водяную с терморегулятором;
весы лабораторные обшего назначения но ГОСТ 24104;
весы торзионные;
гомогенизатор бактериологический или аппарат для измельчения тканей с числом оборотов не менее 8000 об/мин и не более 45000 об/мин; горелки газовые: дистиллятор;
котлы с паровой рубашкой; компаратор;
лупу с увеличением 3—5 по ГОСТ 25706;
микроскоп типа МБИ или МБР или других аналогичных марок:
мясорубку бытовую по ГОСТ 4025;
ножи;
ножницы медицинские по ГОСТ 21239; осветитель ОИ-19;
пинцеты медицинские по ГОСТ 21241; потенциометр или рН-метр;
спиртовки стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336; термостат электрический с автоматическим регулятором: ультратермостат;
флаконы Сокслета (бутылки для детского питания); холодильник электрический бытовой по ГОСТ 16317; часы песочные по ОСТ 25—11—38 на 1, 2, 5 и 15 мин; шкаф сушильный электрический лабораторный; бумагу фильтровальную по ГОСТ 12026; бутылки стеклянные;
вату медицинскую гигроскопическую по ГОСТ 5556; воду бромную;
воду дистиллированную по ГОСТ 6709; воду питьевую по ГОСТ 28741;
воронки стеклянные по ГОСТ 25336. конусообразные, вместимостью 250. 500 см‘; дрожжи прессованные по ГОСТ 171;
желчь крупного рогатого скота свежую или сухую обезвоженну ю; кастрюли;
колбы стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336; кровь крупного рогатого скота, овен, лошадей: марлю медицинскую по ГОСТ 9412; масло вазелиновое медицинское по ГОСТ 3164; масло иммерсионное для микроскопии по ГОСТ 13739;
1
На территории Российском Федерации действует ГОСТ Р 51232-98.
IJ-2264
С. 3 ГОСТ 21237-75
мел химически осажденный по ГОСТ 6253; мясо-говядину по ГОСТ 779; панкреатин пищевой сухой; пенициллин;
пептон венгерской фирмы «Рихтер»;
пептон сухой ферментативный для бактериологических целей по ГОСТ 13805; пептон чешской фирмы «Спофа»; петледержатели; печень говяжью;
пипетки вместимостью I, 2 см3 с иеной деления 0,05 и 0,1 см1 и вместимостью 10 см1;
плазму цитратную кроличью сухую;
желез)’ поджелудочную крупного рогатого скота;
поплавки для пробирок и колб длиной 20. 45 и 75 мм. диаметром соответственно 2, 5 и 10 мм; посуду мерную стеклянную по ГОСТ 1770;
набор агглютинирующих адсорбированных сальмонеллезных сывороток: поливалентной О-сыво-роткн групп А. В. С, D и £’ и моновалентных О- и Н-сывороток; пробирки стеклянные бактериологические по ГОСТ 25336; пробки корковые по ГОСТ 5541; пробки резиновые;
проволоку из никелевых сплавов диаметром 0,3—0.5 мм по ГОСТ 1791;
спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 59621 или спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300;
спирт денатурированный;
стекла покровные по ГОСТ 6672;
стекла предметные по ГОСТ 9284;
ступки фарфоровые с пестиками по ГОСТ 9147;
хлороформ технический по ГОСТ 20015;
цилиндры вместимостью 100. 250, 500 см* по ГОСТ 1770;
чашки с крышками стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336 (чашки Петри);
штативы для пробирок;
шумовку;
эозин бактериологический;
яйца куриные;
бриллиантовый зеленый;
бромтимоловый синий;
генциан фиолетовый (генпнанвиолет);
глицерин по ГОСТ 6259, х.ч.;
Д-глюкозу по ГОСТ 6038, Д (+), х.ч.; желатин по ГОСТ 11293; йод металлический по [‘ОСТ 4159. х.ч.; калий йодистый по ГОСТ 4232, х.ч.;
калий фосфорнокислый дву замещенный по ГОСТ 2493, х.ч.; калий фосфорнокислый однозамешенный по ГОСТ 4198, х.ч.; кислоту карболовую кристаллическую; кислоту фосфорную по ГОСТ 6552; кристаллический фиолетовый (кристаллвиолет); лактозу, х.ч.;
магний сернокислый по ГОСТ 4523. х.ч.; магний хлористый по ГОСТ 4209. х.ч.; маннит (маннитол) по ТУ 6—09— 5484, х.ч., Д (—); синь метиленовую;
метиловый красный по ТУ 6—09—5169; метиловый фиолетовый медицинский (метилвиолет); мочевину по ГОСТ 6691, х.ч.;
1
На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 51652-2000.
ГОСТ 21237-75 С. 4
набор углеводов для исследования ферментации микробов кишечной группы (большой);
натрий-аммоний фосфорнокислый по ГОСТ 4170;
натрия гидроокись по ГОСТ 4328;
натрий двууглекислый по ГОСТ 4201, х.ч.;
натрий кислый селенистокислый (без теллура);
натрий лимоннокислый по ГОСТ 22280;
натрий се рн и стокислый (сульфит натрия) безводный по ГОСТ 195. х.ч.; тиосульфат натрия по ГОСТ 27068. х.ч.;
натрий фосфорнокислый двузамещенный безводный по ГОСТ 11773, х.ч.;
натрий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 245, х.ч.;
натрий хлористый по ГОСТ 4233, х.ч.;
парадиметиламидобензальзегид;
сафранин;
сахарозу по ГОСТ 5833, х.ч.; свиней уксуснокислый по ГОСТ 1027;
соль закиси железа и аммония двойную сернокислую (соль Мора) по ГОСТ 4208; фенол;
феноловый красный по ТУ 6—09—5170. х.ч.; фуксин кислый для микробиологических целей; фуксин основной для микробиологических целей; агар микробиологический по ГОСТ 17206; агар сухой питательный; агар Плоскирева сухой бактериологический; агар сухой висмуг-сульфит;
агар сухой с эозин-метиленовым синим (среда Левина);
воду мясную по ГОСТ 20729;
бульон мясо-пептонный по ГОСТ 20730;
диализат или экстракт дрожжевой;
раствор Хенкса;
сальмонеллезный О-бактериофаг, сибиреязвенный фаг «гамма МВД*.
(Измененная редакция, Изм. № 1, 2).
3. ПОДГОТОВКА К ИССЛЕДОВАНИЮ
3.1. Приготовление питательных сред, реактивов, красок
3.1.1. Приготовление м я с о-п е п т о и и о г о агара
К 1000 см3 мясо-пептонного бульона перед стерилизацией добавляют 20 г агара и кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения.
Мясо-пептонный агар, охлажденный до температуры 50—55 *С, осветляют яичным белком (из расчета один белок на 1000 см! мясо-пептонного агара), помешают в автоклав, не завинчивая крышку автоклава, или в аппарат Коха на 1 ч. чтобы белок свернулся и, оседая, увлек за собой взвешенные частицы. Горячий мясо-пептонный агар фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавливают в нем pH 7,0—7,4, разливают во флаконы или пробирки и 20 мин стерилизуют в автоклаве при температуре 120 *С.
3.1.2. Приготовление основного раствора Хоттингера
1000 г мяса, освобожденного от жира и сухожилий, нарезают кусками размером 1—2 см и опускают небольшими порннями в кастрюлю с двойным количеством кипящей водопроводной воды. Кипятят в течение 15—20 мин, пока цвет мяса не станет серым; это указывает на то, что белки свернулись. Мясо вынимают шумовкой и измельчают на мясорубке. Оставшуюся жидкость фильтруют и в ней устанавливают pH 8,0. Фарш опускают в отфильтрованную жидкость и охлаждают до температуры 40 ‘С в открытой кастрюле, затем добавляют очишенную от жира, соединительной ткани и дважды измельченную поджелудочную железу в количестве 10 % к полученной взвеси (на 1000 см1 жидкости 100 г железы) или сухой панкреатин в количестве 0,5— 1.0 % (в зависимости от его активности). Полученную смесь хорошо размешивают, после чего снова подщелачивают 10 %-ным раствором гидроокиси натрия до pH 7,8—8,0 и повторяют такое же подшелачиванне через 30 мин. Отсутствие сдвига реакции смеси указывают на его доброкачественность.
13*
С. 5 ГОСТ 21237-75
После установления pH смесь переливают в бутыль с хорошо подобранной резиновой пробкой с таким расчетом, чтобы ‘Д часть бутылки оставалась свободной. Затем добавляют в количестве 1—3 % от объема хлороформа (в холодное время года — меньше, чем в теплое), закрывают бутыль пробкой и несколько раз встряхивают, после чего вынимают пробку для удаления избытка хлороформа и тут же снова закрывают.
Через 1—2 ч после добавления поджелудочной железы или панкреатина проверяют реакцию, устанавливают pH 7.4—7,6 и оставляют смесь для переваривания на 7—16 суток при комнатной температуре до образования аморфного осадка.
Первые 3—4 суток переваривания ежедневно проверяют реакцию среды и поддерживают pH на уровне 7,4—7,6. В течение этого времени встряхивают жидкость не менее трех раз в сутки так же. как указано выше. В дальнейшем встряхивать можно реже.
За 1—2 суток до окончания переваривания встряхивание прекращают, чтобы гидролизат отстоялся. Конец переваривания характеризуется следующими признаками: на дне бутылки собирается аморфный осадок; жидкость над осадком просветляется и принимает соломенно-желтый цвет; гидролизат легко фильтруется; реакция на триптофан с бромной водой должна быть положительной (в пробирку наливают 3—4 см3 фильтрованного гидролизата, добавляют три-четыре капли бромной воды); при наличии триптофана жидкость принимает розово-фиолетовый цвет, в то время как контрольная пробирка с гидролизатом без бромной воды имеет желтое окрашивание. 5 %-ный пиролизат должен содержать 1.1 —1,2 % общего азота. После гидролиза жидкость фильтруют через полотняный или бумажный фильтр, сливают в бутыль и стерилизуют в течение 30 мин при температуре 120 *С.
Приготовленную среду можно хранить пять месяцев. Перед употреблением жидкость фильтру ют.
(Измененная редакция, Изм. № 2).
3.1.3. Приготовление бульона Хотти нгера
К 100 см3 основного раствора добавляют 500 см’ водопроводной воды. 3 г хлористого натрия и 0,12 г двузамещенного фосфорнокислого калия. Полученный раствор кипятят в течение 10 мин, фильтруют, устанавливают pH 7,2—7,4 и стерилизуют в течение 20 мин при температуре 120 «С.
3.1.4. Приготовление физиологического раствора
В 1000 см’ дистиллированной воды растворяют 8,5 г химически чистого хлористого натрия. Раствор доводят до кипения, охлаждают, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в колбы или пробирки и стерилизуют 20 мин в автоклаве при температуре 120 *С.
3.1.5. Приготовление среды Левина
К 100 см1 расатавленного мясо-пептонного агара с pH 7,0—7,4, приготовленного по п. 3.1.1, добавляют 2 cms 0,5 %-чото водного раствора предварительно подогретой на водяной бане метиленовой сини, 1,5 см3 2 %-ного раствора эозина (бактериологического), 2 г лактозы и 0.2 г двузамещенного фосфорнокислого калия. Растворы красок готовят на дистиллированной воде и стерилизуют 1 ч при температуре 100 *С. Ilocie добавления всех компонентов в указанном порядке среду тщательно перемешивают. разливают в чашки и подсушивают. Среда должна иметь красно-фиолетовый цвет.
Среда Левина может быть приготовлена из сухой стандартной среды по прописи, указанной на этикетке.
3.1.6. Среды фуксин-сульфитный агар (среда Эндо). бактоагар Плоскирева, висмут-сульфит агар (среда Вильсон-Блера) могут быть приготовлены из сухих стандартных сред по прописи, указанной на этикетке.
3.1.7. Приготовление среды Мюллера
Для приготовления среды Мюллера вначале готовят растворы серноватистокислого натрия и Люголя.
В мерный цилиндр с 50 г серноватистокислого натрия добавляют до 100 см1 дистиллированной воды. Раствор переливают в бутыль и стерилизуют текучим паром в течение 30 мин.
Для приготовления раствора Люголя в 100 см3 дистиллированной воды растворяют 25 г металлического йода. 20 г йодистого калия.
Для приготовления среды Мюллера в стерильные флаконы помешают по 4.5 г мела и стерилизуют их сухим паром в течение 1 ч. Затем наливают в каждый флакон по 90 см* бульона из перевара Хотгннгера, содержащего 0.13—0,15 % амииного азота, устанавливают pH 7,2—7,4 и стерилизуют при температуре 120 *С. После стерилизации вновь устанавливают pH 7,2—7,4. для чего проверяют в одном из флаконов и определяют необходимый для подтитровки данного количества среды объем соляной кислоты или гидроокиси натрия. Затем в асептических условиях перед употреблением добавляют по 2 см1 раствора Люголя и по 10 см1 раствора серноватистокислого натрия.
(Измененная редакция, Изм. № 2).
ГОСТ 21237-75 С. 6
3.1.8. Приготовление среды Кауфмана
К 500 см! стерильной среды Мюллера, приготовленной по п. 3.1.7, добаатяют 25 см* стерильной желчи крупного рогатого скота и 5 см’ 0.1 %-ного водного раствора бриллиантовой зелени. Смесь хорошо взбалтывают, разливают в стерильные флаконы, но не стерилизуют.
3.1.9. Приготовление селенитового Ф-б ульона
Среду готовят из двух основных растворов — А и Б.
Раствор Л состоит из 5 г пептона чешской фирмы «Спофа» или венгерской фирмы «Рихтер», 7 г безводного двузамешенного фосфорнокислого натрия. 3 г однозамешенного фосфорнокислого натрия, 4 г х.ч. лактозы, 100 см’ дистиллированной воды, pH раствора 6.9—7.1. Раствор стерилизуют 30 мин при температуре 112 *С.
Раствор Б состоит из 10 %-ного раствора кислого селеннстокислого натрия, приготовленного на стерильной воде. Раствор готовят непосредственно перед употреблением.
При изменении серии любого из входящих в среду компонентов (пептона, кислого селенисто-кислого натрия, фосфатов) проводят предварительно подтитровку, для чего экспериментально определяют точную пропорцию фосфорнокислого двузамешенного безводного натрия и фосфорнокислого однозамешенного натрия, которая с используемыми образцами пептона и селенистокислого натрия дает pH не выше 6,9—7,1. что регулируется изменением соотношения фосфатов.
Для приготовления селенитовой среды к 50 см1 раствора Л стерильно добавляют 2 см’ раствора Б. Среду разливают в стерильные флаконы или колбы, но не стерилизуют.
3.1.10. Приготовление хлор и сто магниевой среды «М* (моди финн р о и а н н о й)
Среду готовят из трех основных растворов Л. Б и В.
Для приготовления раствора Л в 90 см* дистиллированной воды растворяют 0,42 г сухого ферментативного пептона, 0,7 г хлористого натрия. 0.15 г однозамешенного фосфорнокислого калия. 4 смЛ дрожжевого диализата.
Для приготовления раствора Б в 9 см’ дистиллированной воды растворяют 3.6 г кристаллического хлористого магния.
Раствор В состоит из 0.09 см* 5 %-ного водного раствора бриллиантовой зелени.
Д1Я приготовления хлористомагниевой среды «М» (модифицированной) растворы Л, Б и В смешивают и стерилизуют 30 мин при температуре 112,5 *С.
Концентрированную среду готовят, удваивая содержание всех компонентов, кроме дистиллированной воды.
При отсутствии дрожжевого диализата допускается применять дрожжевой экстракт.
3.1.11. Приготовление дрожжевого экстракта
В 2000 см’ дистиллированной воды растворяют 1000 г прессованных хлебопекарных дрожжей. Полученную суспензию стерилизуют 30 мин текучим паром, затем отстаивают в холодильнике при температуре 4 *С в течение 5—6 суток.
Жидкость над осадком декантируют, приливают 2,5 см’ 0,01 %-ного раствора кристаллического фиолетового, ра.зливают во флаконы или пробирки и вновь стерилизуют при температуре 100 *С в течение 30 мин. Экстракт хранят в холодильнике при температуре 4—6 *С до двух недель.
3.1.12. Приготовление среды Киллиана
К 100 см’стерильного питательного бульона (pH 6,8—6,9) стерильно добаатяют I см ’0,1 %-ного раствора бриллиантовой зелени. Раствор бриллиантовой зелени готовят следующим образом: 0.1 г бриллиантовой зелени заливают 100 см1 дистиллированной воды, помешают во ф1аконы с резиновой или корковой пробкой и помешают в термостат при температуре 37 ‘С на сутки.
3.1.13. Приготовление трехсахарного агара с мочевиной (К р у м в и д е-О л ь к е и и ц к о г о в модификации Ковальчука)
В 1000 см* дистиллированной воды растворяют 2 г глюкозы, 3,5 г сахарозы, 15 г лактозы, 0,6 г соли Мора, 1 г серноватистокислого натрия и 10 г мочевины. Соль Мора и серноватистокнслый натрий предварительно растворяют в 5—7 см’ дистиллированной воды в пробирках. Углеводы и мочевину также растворяют в 10 см5 дистиллированной воды в колбе на водяной бане. До стерилизации устанавливают pH 7,4—7,6 и добавляют 46 г сухой среды с сахарозой и индикатором «ВIV Раствор размешивают и кипятят до расплавления агара, разливают в пробирки по 5—6 см1 в каждую. Среду, разлитую в пробирки, стерилизуют текучим паром 2 дня по 30 мин или при температуре 112 “С в течение 20 мин. После стерилизации среду скашивают так. чтобы остался небольшой столбик (не менее 3 см).
С. 7 ГОСТ 21237-75
3.1.14. Приготовление пептон н о*у глеводиых сред (среды Г и с с а)
К 100 см* дистиллированной воды прибавляют I г сухого ферментативного пептона, 0.5 г хлористого натрия и нагревают до растворения, затем фильтруют до тех пор, пока раствор не станет совершенно прозрачным. Устанавливают pH 0.7, прибавляют 0,5 г углевода и 1 см5 индикатора Андреде.
Среду разливают по 5 см’в пробирки с поплавками и стерилизуют 20 мин при температуре 110 “С. Среда должна быть бесцветной или соломенно-желтого цвета, без розового оттенка. Можно использовать готовые среды Гисса.
Для приготовления индикатора Андреде к ИЮ см’дистиллированной воды добавляют 16,4 см* 1 моль/дм* раствора гидроокиси натрия и 0,5 г кислого фуксина. Раствор стерилизуют 5 мин при температуре 110— 112 ‘С. Индикатор хранят в склянке из темного стекла.
(Измененная редакция, Изм. № 2).
3.1.15. Приготовление пептон ной воды
К 1000 см’ дистиллированной воды добавляют 10 г пептона и 5 г хлористого натрия, кипятят до растворения пептона, фильтруют и устанавливают pH 7,2—7.4, после чего стерилизуют 30 мин при температуре 120 “С.
3.1.16. Приготовление плазмы крови
В пробирку вносят 2 см1 5 %-ного раствора лимоннокислого натрия и 8 см5 только что потученной крови кролика. Цитратную кровь ставят на 18—20 ч в холодильник при температуре 4—6 *С или подвергают центрифугированию при 3000 об/мни в течение 15 мин. В результате чего над осадком эритроцитов образуется прозрачный слой жидкости желтоватого цвета — плазмы, которую разводят физиологическим раствором 1:4.
3.1.17. Приготовление дефибри ннрованной крови
В колбу со стеклянными бусами сливают 8 см3 только что взятой крови кролика, барана, лошади и непрерывно встряхивают в течение 10—15 мин, в результате чего находящийся в крови фибрин выпадает в осадок, обволакивает бусы. Дефибринированную кровь сливают в другую колбу или пробирку. Считая дефибринированная кровь утрачивает способность свертываться.
3.1.18. Приготовление кровяного агара
К 100 см1 расплавленного стерильного мясо-пептонного агара, приготовленного по п. 3.1.1 и охлажденного до температуры 45 «С, стерильно прибавляют 5—10 см5 стерильно взятой дефнбрнниро-ванной крови. Готовую среду разливают в стерильные чашки Петри, дают ей застыть и подсушивают в термостате при температуре 37 *С. Слой агара должен быть равномерно окрашен в красный цвет.
3.1.19. Приготовление агара Симмонса
В 1000 см5 дистиллированной воды растворяют 5 г хлористого натрия, 0.2 г сернокислого магния, 1.5 г фосфорнокислого натрия-аммония, 2 г двузамещенного фосфорнокислого калия, 5 г нейтрального лимоннокислого натрия, 20 г агара. Раствор фильтруют, добавляют 40 см’ раствора бром тимолового синего (1:500). Среду разливают в пробирки по 5—6 см* в каждую, стерилизуют при температуре 120 ‘С в течение 20 мин, посте чего скашивают. Готовая среда должна быть оливкового цвета.
3.1.20. Приготовление среды Государственного контрольного института (ГКИ)
В стерильную колбу наливают 60 см* раствора Хенкса и добавляют стерильно 40 см’ сыворотки крови крупного рогатого скота, прогретой при температуре 56 *С в течение 30 мин. После тщательного перемешивания устанавливают pH 7,2 раствором двууглекислого натрия и разливают среду по 2 см ’ в стерильные пробирки, которые закрывают стерильными резиновыми пробками. Среду можно хранить при температуре 4 С до четырех месяцев.
3.1.21. Приготовление среды Дрожжевкииой
К 10 см3 стерильного желтка куриного яйца добавляют 90 см’ физиологического раствора, тщательно перемешивают. Смесь разливают по 8 см’ в стерильные пробирки. Перед употреблением проверяют стерильность среды, поместив ее в термостат при температуре 37 «С на 48 ч.
3.1.22. Приготовление среды Кит т-Т а р о ц ц и
Свежую печень крупного рогатого скота разрезают на куски массой по 50—60 г. заливают равным количеством воды и кипятят в течение 30 мин при постоянном помешивании. Печеночный экстракт фильтруют через ватно-марлевый фильтр и смешивают с мясо-пептонным бульоном из расчета одна часть печеночного экстракта на три части бульона. Смесь нагревают до кипения, добавляют хлористый натрий из расчета 1,25 г на 1000 см1 среды и устанавливают pH 7,6—7,8, после чего кипятят в течение 15 мин и фильтруют через бумажный фильтр.
ГОСТ 21237-75 С. 8
В пробирки кладут мелко нарезанные кусочки печени по 1,5—2 г и заливают смесью печеночного экстракта с мясо-пептонным бульоном. На поверхность среды наслаивают 0,5—1 см5 вазелинового масла. Среду стерилизуют в течение 30 мин при температу ре 120 *С.
3.1.23. Разведение пенициллина
На каждые 100 тыс. ед. пенициллина добавляют 1 см1 стерильной дистиллированной воды и получают основное разведение, содержащее 100 тыс. ед. пенициллина в 1 см’. Например, во флакон, содержащий 500 тыс. ел. пенициллина, нужно внести 5 см1 дистиллированной воды.
В пять пробирок наливают по 4,5 см! в каждую стерильной дистиллированной воды. В первую пробирку стерильной пипеткой вносят 0,5 см5 пенициллина основного разведения и получают в первой пробирке разведение, содержащее 10 тыс. ед. пенициллина в 1 см* раствора. Новой пипеткой из первой пробирки, тщательно перемешав содержимое, переносят 0.5 см’ раствора во вторую пробирку и получают разведение, содержащее 1000 ед. пенициллина в I см’ раствора. Таким же образом из второй пробирки переносят в третью 0,5 см* и получают разведение, содержащее 100 ед. пенициллина в I см1 раствора. Из третьей пробирки переносят 0.5 см* в четвертую и полу чают разведение, содержащее 10 ед. в 1 см’ раствора. Из четвертой пробирки переносят 0,5 см’ в пятую и получают в пятой пробирке разведение, содержащее 1 ед. пенициллина в 1 см3 раствора.
3.1.24. Приготовление м я с о-п ептонного агара с пенициллином
В три колбочки или большие пробирки, содержащие по 20 см* стерильного расплавленного и
охлажденного до температуры 45—50‘С мясо-пептонного агара (pH 7,2), добавляют в первую колбу 1 см* пенициллина из четвертой пробирки (см. п. 3.1.23), содержащей в I см! 10 ед. пенициллина, тщательно перемешивают, получают агар, содержащий 0,5 ед. пенициллина в I см1, во вторую колбу вносят I см5 из пятой пробирки (см. п. 3.1.23), содержащей в 1 см1 I ед. пенициллина, получают агар, который содержит в 1 см5 0,05 ед. пенициллина; третью колбочку оставляют без пенициллина для контроля. Содержимое всех трех колбочек разливают в стерильные пробирки по 5 см3 в каждую и скашивают.
3.1.25. Приготовление индикаторной бумаги для определения индола
5 г парадиметиламндобензальдегнда, 10 см* очищенной концентрированной фосфорной кислоты растворяют в 50 см’ 96 * спирта. В тепловатом растворе смачивают фильтровальну ю бумагу, высушивают. нарезают узкими полосками. Цвет бумаги — желтый. При наличии индола пвет бумаги меняется от сиреневато-розового до интенсивно малинового. Появление других цветов на индикаторной бумаге не учитывают.
3.1.26. Приготовление индикаторной бумаги для определения сероводорода
В 100 см* дистиллированной воды растворяют 20 г уксуснокислого свинца и 1 г двууглекислого натрия. Этим раствором пропитывают полоски фильтровальной бумаги, высушивают их при температуре 18—23 «С и нарезают на узкие полоски. После приготовления бумага остается белой: при наличии сероводорода чернеет.
3.1.27. Приготовление насыщенного спиртового раствора метиленовой сини
В 100 см5 % * этилового спирта растворяют 8—9 г метиленовой сини. Раствор фильтруют.
3.1.28. Приготовление водно-спиртового раствора метиленовой сини
К 30 см1 дистиллированной воды добавляют 1 см1 насыщенного спиртового раствора метиленовой сини, приготовленной по п. 3.1.27.
3.1.29. Приготовление метиленовой сини Леффлера
К 100 см5 дистиллированной воды добавляют 30 см3 насыщенного спиртового раствора метиленовой сини и 1 см* 1 %-иого раствора гидроокиси калия.
3.1.30. Приготовление насыщенного спиртового раствора фуксина
8—9 г основного кристаллического фуксина высыпают во флакон, заливают 100 см’ 96 * этилового спирта и ставят на 18—24 ч в термостат с температурой 37 ’С. Флакон периодически взбалтывают. В течение указанного времени значительная часть краски растворяется, и на дне флакона остается осадок, свидетельствующий о насыщении раствора.
Насыщенный раствор хранят во флаконах из темного стекла. Из насыщенного спиртового раствора готовят водно-спиртовой раствор фуксина. Для этого к 1 см’ насыщенного раствора добавляют 9 см’ дистиллированной воды.
С. 9 ГОСТ 21237-75
3.1.31. Приготовление карболового фуксина Циля
1 г основного кристаллического фуксина растирают в ступке с 5 г кристаллической карболовой кислоты (фенола) и 0.5 см1 глицерина. Во время растирания небольшими порциями прибавляют 10 см’ % » этилового спирта. После того, как краска полностью разотрется, прибавляют при постоянном помешивании 100 см’ дистиллированной воды. Раст вор краски фильтруют. Фуксин Циля стойкий и его хранят во флаконах из темного стекла с притертой пробкой.
3.1.32. Приготовление карболового кристаллического фиолетового. генциа н-ф нолетового или метилового фиолетового для окраски по Граму
1 г кристалл-, генциан- или метил виол ета растирают в ступке с 2 г кристаллической карболовой кислоты (фенола). Во время растирания небольшими порциями прибавляют 10 см-‘ % * этилового спирта. После того, как краска полностью растворится, прибавляют при постоянном помешивании 100 см5 дистиллированной воды. Раствор краски фильтруют через бумажный фильтр. Растворы нестойкие.
3.1.33. Приготовление красящей бумаги по Синеву
В 100 см’ 96 * этилового спирта растворяют I г кристаллвиолета и 1 см* глицерина. Краску наливают в лоток. Бумагу нарезают полосками шириной 2,0—2,5 см и длиной 30—50 см. Полоску погружают па несколько секунд в краску так. чтобы она окрасилась с обеих сторон. Окрашенные полоски вынимают пинцетом, дают краске стечь и подвешивают на шпагате для высушивания. Бумагу сушат на воздухе при комнатной температуре 18—23 *С. Высушенные полоски бумаги разрезают на кусочки размером 2 2 см и хранят в банке из темного стекла.
3.1.34. Приготовление раствора Люголя
В 10 см* дистиллированной воды растворяют 2 г йодистого калия. Затем прибавляют 1 г кристаллического йода. Раствор выдерживают 5—6 ч до полного растворения йода, после чего прибавляют 290 см’ дистиллированной воды. Хранят раствор в склянке из темного стекла.
3.2. Окраска препаратов
3.2.1. Окраска мазков по Граму (общепринятая модификация)
На фиксированный мазок помешают полоску фильтровальной бумаги и наливают карболовый
генпианвиолет. Выдерживают 1—2 мин, после чего снимают бумажку, сливают краску, мазок промывают водой и наливают на него раствор Люголя (мазок чернеет). Через 1—2 мин раствор сливают и наливают этиловый спирт на 0,5— 1 мин. Затем мазок промывают водой и дополнительно окрашивают водным фуксином или водным раствором сафранина в течение 1—2 мин. Затем промывают водой и просушивают мазок фильтровальной бумагой.
Окраску по Граму можно применять в водоизменении Синева, согласно которому вместо карболового генцианвиолета применяют окрашенные полоски фильтровальной бумаги, приготоатеиной по п. 3.1.33. Для окрашивания мазков на фиксированный мазок накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной спиртовым раствором кристаллвиолета, и наносят две-три капли воды, которые полностью впитываются бумагой, последняя плотно прилегает к стеклу. Выдерживают 2 мин, затем бумагу удаляют пинцетом и дальнейшую окраску производят по Граму.
3.2.2. Окраска капсул методом Ольта
Мазки окрашивают 2 %-ным водным раствором сафранина в течение 1—3 мин (лучше при подогревании) и быстро смывают водой. Раствор сафранина готовят перед употреблением: сафранин растворяют в воде, доведенной до кипения и фильтруют через бумажный фильтр.
3.2.3. Окраска капсул методом Ребигера
Мазки окрашивают и фиксируют одновременно. Готовят раствор: 15—20 г гениианвиолета растворяют в 100 см1 40 %-ного формалина. Раствор оставляют на 8—10 ч при температуре 20 *С. фильтруют, после чего он готов к употреблению. Окрашивают нефиксированные мазки в течение 15—20 с, быстро промывают вод о А и высушивают фильтровальной бумагой.
3.3. Подготовка образцов к исследованию и проведению посева
3.3.1. Каждый предстаапенный к исследованию образец (мышцы, лимфатические ухты, паренхиматозные органы) перед посевом освобождают от видимой жировой и соединительной ткани, погружают па 2—3 мин в спирт и два раза обжигают с поверхности. Затем стерильными ножницами из глубины рапичных мест каждого образца вырезают кусочки размером не менее 2,0 1,5 2,5 см; лимфатические ухты разрезают пополам. Затем все вырезанные кусочки измельчают стерильными ножницами.
3.3.2. Для посева составляют две пробы по 15 г каждая. Одна проба состоит из кусочков мышц и лимфатических узлов, а вторая — из кусочков паренхиматозных органов (печени, почки и селезенки).
ГОСТ 21237-75 С. 10
3.3.3. Каждую пробу в отдельности помешают в стерильный стакан (колбу) гомогенизатора для приготовления взвеси. Для этого в стакан (колбу) добавляют по 15 см1 физиологического раствора, количество которого равно массе каждой пробы, и гомогенизируют пробы в электрическом гомогенизаторе. Вначале измельчают материал замедленной частотой оборотов, затем с большей частотой оборотов не более 2.5 мин (в зависимости от числа оборотов).
1 см3 приготовленной взвеси содержит 0.5 г продукта.
3.3.4. Полученные взвеси отстаивают 10 мин. Из верхней части надосадочной жидкости пипеткой Мастера или петлей вносят на чашку с мясо-пептонным агаром и элективной средой (Эндо, Левина) одну-две капли или одну петлю и тщательно втирают материал в поверхность предварительно подсушенных сред.
3.3.5. Одновременное посевом на плотные среды производят посев материала для накопления сальмонелл в одну из сред обогащения (селенитовый Ф-бульон, Мюллера, Кауфмана, Киллиана, хлористомагниевую среду «М»). Для этого 20 см1 взвеси из мыши и лимфатических углов вносят в один флакон (колбу), а 20 cmj взвеси из паренхиматозных органов — в другой. В каждый флакон наливают по 50 см1 среды обогащения.
При отсутствии гомогенизатора допускается посев кусочка пробы размером не менее 2,0 1.5 2,5 см (путем нанесения отпечатков разными сторонами пробы на поверхность питательной среды в чашках с предварительно подсушенным мясо-пептонным агаром и элективной средой Эндо, Левина). При этом необходимо произвести также посев на элективные среды из лимфатического узла печени или соскоба с внутренней стенки желчного пузыря. Посев в среду обогащен
